實(shí)驗(yàn)室超常用的蛋白濃度測定方法，看這一篇就夠了！選對方法，實(shí)驗(yàn)效率倍增！

蛋白質(zhì)中的色氨酸（Trp）酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基在280nm附近有紫外吸收峰通過測量蛋白質(zhì)溶液在 280 nm 處的吸光度值，可以估算蛋白質(zhì)濃度基于Beer-Lambert定律：A=εbc，其中A是吸光度，ε是摩爾消光系數(shù)，b是光程，c是濃度對于蛋白質(zhì)，ε和b在特定條件下可以視為常數(shù)，因此吸光度A與濃度c成正比通常假設(shè)蛋白質(zhì)的平均消光系數(shù)ε約為1.0(mg/mL)^-1 cm^-1

快速簡便

操作非常簡單快捷，只需使用紫外分光光度計(jì)直接讀取280nm處的吸光度即可

非破壞性

樣品可以回收，因?yàn)闇y量過程中樣品沒有被化學(xué)修飾或消耗

不需要試劑

除了緩沖液，不需要額外的化學(xué)試劑

適用于高濃度蛋白質(zhì)

在高濃度范圍內(nèi)也相對準(zhǔn)確

干擾多

核酸(DNA,RNA)在 260 nm 處也有很強(qiáng)的紫外吸收，在 280nm 處也有一定吸收，會干擾蛋白質(zhì)的測定其他一些小分子物質(zhì)也可能在 280 nm 處有吸收，造成結(jié)果偏差

靈敏度較低

對于低濃度的蛋白質(zhì)溶液，吸光度值可能太低，誤差較大

準(zhǔn)確性受蛋白質(zhì)組成影響

不同蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸含量差異很大，導(dǎo)致其摩爾消光系數(shù)差異也很大使用平均消光系數(shù)進(jìn)行估算，準(zhǔn)確性會受到蛋白質(zhì)自身氨基酸組成的影響如果蛋白質(zhì)樣品中Trp 和 Tyr 含量異常高或異常低，誤差會更大

需要純凈樣品

樣品中不能含有大量干擾紫外吸收的物質(zhì)，如核酸某些染料等

考馬斯亮藍(lán)G-250染料在酸性條件下與蛋自質(zhì)結(jié)合，染料從紅色形式（最大吸收波長在465 nm）轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色形式（最大吸收波長在595 nm）這種顏色的轉(zhuǎn)變是由染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，染料分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起的結(jié)合主要是通過靜電相互作用和范德華力，特別是染料的磺酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸殘基（如精氨酸賴氨酸和組氨酸）以及芳香氨基酸殘基的非極性區(qū)域相互作用顏色的深淺（在595 nm 處的吸光度）與蛋白質(zhì)濃度成正比

靈敏度較高

比紫外吸收法靈敏度高，適用于測定較低濃度的蛋白質(zhì)

操作簡便快捷

試劑單一，操作步驟少，反應(yīng)迅速，通常幾分鐘內(nèi)即可完成

受樣品中鹽和緩沖液干擾小

相對于其他比色法，受樣品中常見的鹽緩沖液等干擾較小

穩(wěn)定性好

染色后的藍(lán)色復(fù)合物在室溫下可以穩(wěn)定一段時間，方便讀取數(shù)據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

需要使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(通常是牛血清白蛋自BSA)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，才能定量不同蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合能力有所差異，因此使用 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線測定其他蛋白質(zhì)，結(jié)果可能存在偏差

蛋白質(zhì)種類依賴性

不同蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合能力不同，導(dǎo)致對不同蛋白質(zhì)的定量結(jié)果準(zhǔn)確性不同堿性氨基酸和芳香氨基酸含量高的蛋白質(zhì)測定結(jié)果相對準(zhǔn)確，反之則可能偏差較大

試劑會染色比色皿

考馬斯亮藍(lán)染料容易染色玻璃或塑料比色皿，需要小心操作，或者使用一次性比色皿

線性范圍有限

在較高蛋白濃度下，反應(yīng)可能出現(xiàn)飽和，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線非線性

對去垢劑敏感

一些去垢劑，如SDS，會干擾Bradford反應(yīng)

Lowry法是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法，基于兩個連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)第一步是蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子在堿性條件下反應(yīng)，形成復(fù)合物，銅離子被還原為亞銅離子第二步是還原的亞銅離子還原FolinCiocalteu試劑(磷鉬酸和磷鎢酸的混合物)，使試劑顯色，產(chǎn)生藍(lán)色顏色的深淺(通常在750nm或660nm處測量吸光度)與蛋白質(zhì)濃度成正比

靈敏度較高

比紫外吸收法和 Bradford 法更靈敏，可以檢測更低濃度的蛋白質(zhì)

受蛋白質(zhì)組成影響相對較小

因?yàn)槭腔陔逆I反應(yīng)，受不同蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響比 Bradford 法小一些

操作步驟繁瑣

需要多個試劑，操作步驟較多，耗時較長

試劑不穩(wěn)定

Folin-Ciocalteu 試劑不穩(wěn)定，容易受還原性物質(zhì)污染，需要臨用前配制

干擾多

容易受到多種化學(xué)物質(zhì)的干擾，包括一些緩沖液成分（如Tris，EDTA），以及非離子型去垢劑還原劑等需要嚴(yán)格控制樣品和試劑的純度

時間依賴性

顯色反應(yīng)需要精確控制反應(yīng)時間和溫度，反應(yīng)時間過長或過短都會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

同樣需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

BCA法原理與Lowry法類似，也是基于兩個步驟的反應(yīng)第一步是蛋白質(zhì)中的肽鍵將銅離子 在堿性條件下還原為亞銅離子 第二步是亞銅離子與 BCA試劑(二喹啉甲酸)反應(yīng)，形成紫色的 BCA-Cu*復(fù)合物，該復(fù)合物在 562nm 處有最大吸收顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比

靈敏度高

與 Lowry 法靈敏度相當(dāng)，比 Bradford 法和紫外吸收法高

操作相對簡便

試劑相對穩(wěn)定，通常試劑以預(yù)混形式提供，操作步驟比Lowry 法簡化

受去垢劑干擾小

相對于 Lowry 法，受一些去垢劑(如 SDS,Triton X-100)的干擾較小，更適用于含有去垢劑的樣品

線性范圍較寬

BCA法的線性范圍比 Bradford 法寬

穩(wěn)定性好

顯色后的復(fù)合物比 Bradford 法更穩(wěn)定，可以放置較長時間再讀取數(shù)據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

銅離子還原反應(yīng)

基于銅離子還原反應(yīng)，容易受到還原性物質(zhì)的干擾

時間和溫度依賴性

反應(yīng)需要加熱孵育，結(jié)果受時間和溫度影響

對脂類物質(zhì)敏感

脂類物質(zhì)會干擾 BCA反應(yīng)

雙縮脲法是最早用于蛋白質(zhì)定量的方法之一在強(qiáng)堿性條件下，含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物(包括蛋白質(zhì))可以與銅離子反應(yīng)，形成紫紅色的絡(luò)合物這種絡(luò)合物的最大吸收波長在540nm左右顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比

受蛋白質(zhì)組成影響最小

因?yàn)槭侵苯优c肽鍵反應(yīng)，受不同蛋白質(zhì)氨基酸組成差異的影響最小，對不同蛋白質(zhì)的定量相對比較準(zhǔn)確

干擾少

受樣品中常見的鹽緩沖液以及一些小分子物質(zhì)的干擾較小

靈敏度低

相對于 Bradford法Lowry法和BCA法，靈敏度最低，通常只能用于測定較高濃度的蛋白質(zhì)(>1mg/mL)

需要大量樣品

由于靈敏度低，需要較高濃度的蛋白質(zhì)樣品和較大量樣品才能獲得可讀的吸光度值

操作步驟較多

需要配置試劑，操作步驟相對繁瑣

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

在實(shí)驗(yàn)室蛋白檢測的各個環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)耗材的品質(zhì)對檢測結(jié)果的可靠性有著重要影響愛津生物扎根生命科學(xué)領(lǐng)域，憑借多年積累的技術(shù)與持續(xù)創(chuàng)新，擁有一系列適配蛋白檢測的耗材，包含普通吸頭（低吸附款）酶標(biāo)板微量離心管常規(guī)離心管細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶等